? ? ?有人問到：“我的工藝是流穿模式，是否需要評價(jià)柱效？”還有人問到：“我的工藝是親和層析，單梯度洗脫，不用擔(dān)心拖尾，是否需要評價(jià)柱效？”今天，小編為大家進(jìn)行統(tǒng)一解答。

什么是柱效？

? ? ?柱效（column efficiency），是指層析柱保留某一物質(zhì)而不使其擴(kuò)散的能力。柱效越高，則分離度越高。

塔板理論及柱效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

? ? ? 馬丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理論，將層析柱比作蒸餾塔，把一根層析柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動(dòng)相。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入層析柱后，就在兩相間進(jìn)行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達(dá)到分配平衡，這樣一個(gè)小段稱作一個(gè)理論塔板（theoretical plate）。經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。

理論塔板數(shù)（N）計(jì)算公式：

? ? ? 該公式中的Ve，必須從進(jìn)樣時(shí)起算。

? ? ??每米理論塔板數(shù)（N/m）=理論塔板數(shù)（N） ÷ 柱床高度。

? ? ? HETP（height equivalent of theoretical plate），理論塔板等量高度，即每一層理論塔板的高度。

? ? ? 簡單來說，每米理論塔板數(shù)，是指每米有多少層；HETP，是指每一層有多高。可以說兩者是互為倒數(shù)的關(guān)系。

? ? ?評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：一般情況下，認(rèn)為HETP ＜4倍粒徑大小即為比較理想的柱效。比如裝填平均粒徑90 μm的Sepharose填料，則要求HETP ＜360 μm，通過計(jì)算，要求每米理論塔板數(shù) ＞2778。或可根據(jù)實(shí)際情況，將柱效標(biāo)準(zhǔn)定為每米理論塔板數(shù) ≥3000。

對稱性，也稱峰不對稱因子（Asymmetry, As），用來評價(jià)層析柱裝填的均勻程度。

? ? ??As?=b/a。As ＞1，說明裝填偏松，表現(xiàn)為峰拖尾；As ＜1，說明裝填偏緊，表現(xiàn)為峰前沿。若對分離度有較高要求，可把標(biāo)準(zhǔn)定為0.8 ＜As ＜1.2；若對分離度要求并不高，可把標(biāo)準(zhǔn)定為0.8 ＜As ＜1.5，甚至更寬的范圍。

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是否一定要評價(jià)柱效？

? ? ? 總體來說，還是建議進(jìn)行柱效評價(jià)的，但柱效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不能一概而論。

? ? ??高標(biāo)準(zhǔn)：1）分子篩層析；2）反相層析；3）疏水層析；4）采用階性梯度或線性梯度洗脫的離子交換層析。此類層析對分離度有較高要求，有些需要采用多梯度洗脫或線性洗脫，如果柱效不佳，往往會(huì)造成峰擴(kuò)散或拖尾，會(huì)對純化效果產(chǎn)生很大影響。建議標(biāo)準(zhǔn)：HETP ＜4倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.2。

? ? ? 低標(biāo)準(zhǔn)：1）親和層析；2）采用單梯度洗脫的離子交換層析。此類層析僅需采用單梯度洗脫，有時(shí)在產(chǎn)物洗脫下來后，還要立即進(jìn)行稀釋，以防產(chǎn)物聚集，因此對分離度要求較低。然而，過于嚴(yán)重的峰擴(kuò)散和拖尾，也是會(huì)影響純化效率的，因此柱效測定也必不可少。建議標(biāo)準(zhǔn)：HETP ＜5倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.5。

? ? ? 僅要求峰型及對稱性：流穿模式。此類模式為目標(biāo)產(chǎn)物流穿，雜質(zhì)被吸附，如果填料裝填不均勻，或者過于松散，仍會(huì)導(dǎo)致吸附不勻而影響載量和處理量。因此，評估柱效時(shí)建議觀察一下峰型及對稱性，如果峰型平滑，且對稱性良好，即可接受。建議標(biāo)準(zhǔn)：0.8 ＜As ＜1.5。當(dāng)然，如果裝填工藝穩(wěn)定，甚至進(jìn)行了工藝驗(yàn)證，該模式也可以不進(jìn)行柱效評價(jià)。

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柱效評價(jià)的常見問題及處理

前沿峰

可能原因：壓縮過緊。

解決辦法：重新裝填。

拖尾峰

可能原因：1）壓縮過松；2）管路過粗，或檢測器流通池體積過大，造成稀釋效應(yīng)。

解決辦法：1）重新裝填；2）檢查管路及檢測器流通池規(guī)格是否匹配。

低柱效

? ? ? 可能原因：1）沉降不均勻；2）碎填料過多；3）檢測器或泵故障。

? ? ??解決辦法：1）降低勻漿濃度，確保攪拌均勻后一次性緩慢倒入層析柱；2）去除碎填料；3）檢查檢測器及泵是否正常；4）考慮更換為粒徑更細(xì)的填料以提高柱效，如TOSOH聚合物基材填料（http://www.kidkraft.org.cn/brand/view/1.html）。

峰型不佳

? ? ? 可能原因：1）柱床中心凹陷，或柱床與篩網(wǎng)之間存有氣泡，導(dǎo)致樣品流動(dòng)不均勻（樣品需要繞過凹陷區(qū)或氣泡）；2）裝填不均勻，甚至內(nèi)部有裂縫；3）篩網(wǎng)堵塞，導(dǎo)致樣品流動(dòng)不均勻；4）層析柱無分配器，或分配器設(shè)計(jì)不佳，導(dǎo)致偏流。

? ? ??解決辦法：1）重新裝柱，優(yōu)化裝柱策略；2）拆卸、清洗篩網(wǎng)，并確認(rèn)篩網(wǎng)孔徑是否合適；3）采用具有合理分配器設(shè)計(jì)的層析柱。

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