很多藥企做細胞株篩選，或者抗體糖型的培養(yǎng)工藝調(diào)節(jié)，搖瓶培養(yǎng)的數(shù)量都是非常大的，需要進行一系列的平行實驗、對比實驗，等到樣品收獲時，給下游純化人員所造成的純化壓力也是巨大的。經(jīng)常聽到有人抱怨：領(lǐng)導(dǎo)一直催著完成純化，需要送檢看結(jié)果，可是再催，純化步驟也還得一步一步來，那么多樣品，怎么可能在短時間內(nèi)完成所有純化？
1）Protein A - Desalting
第一步：Protein A，1?mL預(yù)裝柱
第二步：Desalting（分子篩脫鹽換液），10?mL預(yù)裝柱
方法信息 | |
純化步驟 | Protein A?- Desalting |
第一步?– Protein A | |
Buffer A –?平衡液 | 25?mM?PB, 150mM NaCl, pH 7.4 |
Buffer B –?洗脫液 | 100mM citrate, pH 3.5 |
Buffer C –?NaOH | 0.1?M?NaOH |
樣品上清液 | 10?mL CHO單抗上清液，濃度1.0 mg/mL |
第二步–?Desalting | |
Buffer D –?平衡液 | 25?mM?PB, pH 7.4 |
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??層析過程圖譜：
結(jié)果匯總 | |
產(chǎn)品濃度 | 3.7 mg/mL |
產(chǎn)量 | 9.92 mg |
單體含量 | 96.5% |
聚集體含量 | 3.2% |
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2）IMAC - Desalting
第一步：IMAC，1?mL預(yù)裝柱Chelate (Cu2+)
第二步：Desalting（分子篩脫鹽換液），10?mL預(yù)裝柱
方法信息 | |
純化步驟 | IMAC - Desalting |
第一步?–?IMAC | |
Buffer A –?平衡液 | 25?mM?PB, 0.5?M NaCl, 10?mM imidazole, pH 7.5 |
Buffer B –?洗脫液 | 25?mM?PB, 0.5?M NaCl, 0.5?M imidazole, pH 7.5 |
Buffer C –?NaOH | 0.1?M?NaOH |
樣品上清液 | 5?mL E. coli BL21(DE3)細胞裂解液，過量表達20 kDa?His6-UCB9 (濃度0.5mg/mL) |
第二步–?Desalting | |
Buffer D –?平衡液 | 1x PBS, pH 7.4 |
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??層析過程圖譜：
結(jié)果匯總 | |
產(chǎn)品濃度 | 1.1?mg/mL |
產(chǎn)量 | 2.3?mg |
單體含量 | 98.1% |
聚集體含量 | 1.9% |
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3）Protein A - CIEX - Desalting
第一步：Protein A，1?mL預(yù)裝柱
第二步：CIEX，5 mL預(yù)裝柱（SP）
第三步：Desalting（分子篩脫鹽換液），10?mL預(yù)裝柱
方法信息 | |
純化步驟 | Protein A?-?CIEX?- Desalting |
第一步?– Protein A | |
Buffer A –?平衡液 | 25?mM?PB, 150mM NaCl, pH 7.0 |
Buffer B –?洗脫液 | 100mM citrate, pH 3.5 |
Buffer C –?NaOH | 0.1?M?NaOH |
樣品上清液 | 10?mL CHO單抗上清液，濃度1.0 mg/mL |
第二步?–?CIEX | |
Buffer?D–?平衡液 | 25?mM?PB, pH?6.0 |
Buffer?E?–?洗脫液 | 25?mM?PB,?0.5 M NaCl,?pH?6.0 |
Buffer C –?NaOH | 0.1?M?NaOH |
第三步?–?Desalting | |
Buffer?F?–?平衡液 | 25?mM?PB, pH 7.0 |
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??層析過程圖譜：
結(jié)果匯總 | |
產(chǎn)品濃度 | 0.91?mg/mL |
產(chǎn)量 | 6.7?mg |
單體含量 | 99.5% |
聚集體含量 | 0.5% |
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4）高通量（HT）純化應(yīng)用
??將Discovery系統(tǒng)額外擴展出35個入口用于上樣，即實現(xiàn)整合化層析的高通量純化應(yīng)用。通過Discovery Wizard，可將每個入口的上樣體積、流速等信息預(yù)先設(shè)定，即可實現(xiàn)高通量自動化操作。
??采用Protein A - CIEX - Desalting三步向?qū)K，每次上樣10 mL單抗上清液（1.0 mg/mL），每次產(chǎn)量均≥6.5 mg。單個樣品的純化耗時約為74 min，在24 h內(nèi)純化出多達19個樣品！而且該時間包含了層析柱的清洗環(huán)節(jié)。該系統(tǒng)持續(xù)運行5天，純化樣品總數(shù)量高達91個。
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