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第七十七期 TSKgel色譜柱在尺寸排阻色譜法分離多肽中的應用

2015年12月23日source:管理員
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前 言

??? 采用高性能尺寸排阻色譜法(GFCSEC)進行多肽分離,操作簡便,不僅可用作檢測分子量的手段,還可作為純化多肽與蛋白質分解產物如多肽片斷的方法之一。可與反相色譜法(RPC)及離子交換色譜法(IEC)聯用。同時,在臨床上還通過把GFC進行比較,來推測病程的進展。

??? 表1所示為TSKgel色譜柱在采用GFC法進行多肽分離的相關文獻及其概要。


??? 各作者均對洗脫液進行了細致的分離,明確了GFC法中使用的洗脫液對分離性能與分餾后處理會產生影響。一般情況下,采用GFC法分離多肽所使用的填充劑多為TSKgelSW硅膠型填料而非TSKgelPW樹脂型填料。

??? 本報告中,將針對這些填充劑(TSKgel G2000SWXL以及TSKgel G2500PWXL)在多肽分離的應用上進行探討。


實例應用

1)標準多肽的分離

??? 表2所示為各多肽標準液的洗脫體積,圖1所示為標準曲線。洗脫液采用含有45%乙腈的0.1%TFA溶液。所有TSKgel G2000SWXL的樣品洗脫速度均慢于TSKgel G2500PWXL。同時,在TSKgel G2000SWXL中,肌球蛋白(MW17800)進入填充劑的小孔內部,但在TSKgel G2500PWXL中,肌球蛋白被小孔排阻,從外水體積中被洗脫。根據其結果,可認為TSKgel G2500PWXL在上述洗脫液條件下的多肽分子量排阻界限推測為8000,相比之下,硅膠型填充劑TSKgel G2000SWXL,可適用于從低分子量到高分子量區域更廣的范圍。

??? 另一方面,如樣品分子量低于3000TSKgel G2500PWXL顯示的標準曲線與TSKgel G2000SWXL幾乎趨于相同,分離范圍非常接近。但是,對比各多肽的洗脫體積,兩者尚存有微妙的區別(尤其是亮氨酸腦啡肽),這是由于在分離過程中樣品與填充劑之間的相互作用(離子性、疏水性的相互作用等)而造成的影響。

???

??? 圖23所示為TSKgel G2500PWXLTSKgel G2000SWXL在分離多肽標準品時的對比圖。通過色譜圖可以明確的看出,TSKgel G2000SWXL吸收峰形與分離帶的寬度均更佳,因此其分離性能更為優異。另一方面,如果多肽的分子量小于1000,由于樣品與填充劑之間的某些相互作用,使用TSKgel G2500PWXL時的分離效果要高于TSKgel G2000SWXL。例如圖2中所示的后葉催產素(MW1007)與亮氨酸-腦啡肽(MW555)、以及圖3所示的TRHMW362)與甘氨酸(MW75)均顯示了其分離效果高于TSKgel G2000SWXL

??? 如上所述,在整體上,TSKgel G2000SWXL具有更高的分離效果,但對于分子量低于1000的多肽樣品,TSKgel G2500PWXL的分離效果會更佳。另外,由于TSKgel SW型硅膠填充劑不具有耐堿性,如樣品需要在堿性條件下進行分離,或使用NaOH溶液進行色譜柱清洗時,請考慮使用TSKgel PW型色譜柱。

2)蛋白消化物的分離

????圖4所示為分離基因重組ProteinATRCK-胰蛋白酶消化物的實例。樣品中含有與蛋白質消化物分子量不同的各類多肽。如上所示,由于TSKgel G2000SWXL色譜柱的分離范圍較寬,其分離效果也更好。(該樣品通過RPC分析的結果,可觀察到約有60種多肽峰在RPC下被檢測到)。


總 結

??? 表3所示為采用尺寸排阻色譜法進行多肽分離時,TSKgel色譜柱產品的不同性能。一般考慮采用TSKgel G2000SWXL較為適合,但考慮到填充劑的耐堿性與多肽的分子量大小等因素,也可根據情況而選擇使用TSKgel G2500PWXLTSKgel G3000PWXL

TSKgel

多肽、蛋白質的分子量區間范圍

特征

TSKgel G2000SWXL

100-100000*

首選色譜柱

分離范圍大

分離效果好

TSKgel G2500PWXL

100-5000

用于低分子量的多肽樣品

具有耐堿性

TSKgel G3000PWXL

1000-50000

用于高分子量的多肽樣品

具有耐堿性

*預估值


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