第135期? 東曹色譜產(chǎn)品在質(zhì)粒DNA純化與分析中的應(yīng)用

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質(zhì)粒（plasmid）是一種小型環(huán)狀DNA，在基因工程中常利用質(zhì)粒作為運(yùn)載體，將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)。雖然近年來(lái)開(kāi)發(fā)了不少更為先進(jìn)的基因轉(zhuǎn)移載體（如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體等），但質(zhì)粒載體由于制備簡(jiǎn)便以及在各類細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染率，仍然被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用。

隨著基因治療的迅速發(fā)展，高純度的質(zhì)粒DNA的需求量越來(lái)越大。在純化質(zhì)粒DNA時(shí)，除了需要去除混入的蛋白質(zhì)、RNA、內(nèi)毒素和宿主基因組DNA等雜質(zhì)以外，還需要去除質(zhì)粒DNA的立體異構(gòu)體Open circular體（開(kāi)環(huán)狀質(zhì)粒）和Linear體（直鏈線狀質(zhì)粒），只對(duì)Supercoiled體（超螺旋狀質(zhì)粒）進(jìn)行純化。

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質(zhì)粒的色譜分離模式

Ref.: Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified

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使用陰離子交換色譜分析質(zhì)粒DNA

基因治療實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒純度的檢測(cè)方法之一是測(cè)量開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒的相對(duì)量。下圖是采用陰離子交換色譜柱TSKgel DNA-NPR分析質(zhì)粒的譜圖。此款色譜柱采用無(wú)孔的親水聚合物基質(zhì)填料，表面由弱陰離子交換基團(tuán)改性，具有極高的蛋白回收率。適用于對(duì)DNA片段，PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒的高效分離。

質(zhì)粒的純化工藝步驟示例

在質(zhì)粒DNA的純化工藝中通常使用陰離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析。質(zhì)粒DNA與內(nèi)毒素相比，其疏水性非常低，所以使用疏水填料可以從質(zhì)粒DNA中有效去除內(nèi)毒素。

Ref.: S.Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified

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使用Toyopearl Butyl-650S疏水填料純化質(zhì)粒

使用TSKgel和TOYOPEARL分離純化質(zhì)粒載體的應(yīng)用實(shí)例